19.6 Testy cytotoxicity na buňkách pěstovaných in vitro

Všechny materiály, které mají být implantovány do lidského organismu, musí být testovány na toxicitu pro buňky a tkáně organismu, na karcinogenitu, tj. zda nevyvolávají v organismu zhoubné bujení, a konečně, zda jejich přítomnost nevyvolá nežádoucí imunitní reakce. Série testů je obvykle zahajována testováním cytotoxicity. Tyto testy se dělí do několika skupin podle toho, co testovaná látka v buňce ovlivňuje:
Viabilita
Testy spočívají v porušení membránové integrity, vymezené vychytáním barviva, pro které je normálně buněčná membrána nepropustná (např. trypanová modř), nebo uvolněním barviva či izotopu, který je ve viabilních buňkách normálně zadržován (např. diacetyl fluorescein, neutrální červeň, laktát dehydrogenáza). Viabilní buňky vychytávají diacetyl fluorescein a hydrolyzují jej na fluorescein, pro který je membrána živých buněk nepropustná. Živé buňky fluoreskují zeleně, mrtvé buňky nefluoreskují. Neviabilní buňky mohou být obarveny ethidium bromidem nebo pro-pidium jodidem a fluoreskují červeně. Do této kategorie patří rovněž agar difúzní test a filtrační test.
(http://www.devicelink.com/mddi/archive/98/04/013.html, http://embryo.ib.amwaw.edu.pl/invittox/prot/31.htm)

Proliferace
Účinek chemických látek na buněčnou proliferaci je určován nárůstem počtu buněk. To se dá provést měřením celkového buněčného proteinu (zkouška s brilantovou modří nebo Coomasie modří), DNA (inkorporací radioaktivně značených nukleotidů) nebo ATP (identifikací síly luminiscence). Dnes dáváme přednost měření poměru ATP/ADP, protože viabilní buňky zacho-vávají tento poměr konstantní a tato hodnota je lepším indikátorem toxického účinku látky na buňku než samotná hodnota ATP.

Metabolická aktivita
Tyto zkoušky se soustřeďují na biologické funkce uvnitř intaktních buněk jako alternativa k testům permeability. Ve viabilních buňkách jsou tetrazoliové soli redukovány extramitochon-driálními dehydrogenázami na barevné formazanové sloučeniny. Produktem této reakce je buď nerozpustný formazan, nebo ve vodě rozpustné formazany, které nevyžadují kvantitativní extrak-ci. Tyto testy jsou prováděny na 96-jamkových destičkách, což je časově i finančně výhodnější.

DNA čipy a microarrays
Většina xenobiotik pravděpodobně přímo nebo nepřímo ovlivňuje molekulární signalizaci, a tím mění expresi genů. Nová disciplína in vitro toxikologie – toxikogenomika – se zaměřuje na tuto problematiku použitím vyspělých technologií zvaných DNA čipy (microarrays). DNA micro-array tvoří pevný základ, na který jsou aplikovány tisíce sekvencí DNA. Ty mohou být navázány na skleněné podložky nebo nylonové a nitrocelulózové membrány. Ukotvené DNA jsou použity k identifikaci cílových sekvencí od kontrolních a léčených jedinců a určení vlivu toxické látky na vzestup či pokles genové exprese. DNA microarrays umožňují analýzu vlivu podávané látky až na 10.000 genů a brzy budeme schopni studovat celý genom vybraných druhů.
(viz animace http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html)
V některých testech je zkoušený materiál v přímém kontaktu s buňkami, v jiných je kontakt materiálu nepřímý, např. přes vrstvu agaru (agar difúzní testy) nebo přes ultrafiltr (testy na mem-bránovém ultrafiltru Millipore). Některými testy lze hodnotit pouze pevné materiály, jiné jsou vhodné i pro materiály tekuté nebo výluhy z materiálů pevných.

19.6.1 Agar difusní test
Umožňuje sledovat toxicitu pevných materiálů nebo výluhů z nich na buňkách pěstovaných in vitro po 24 hodinovém působení. Agarová vrstva zabezpečuje rovnoměrnou difúzi látek uvol-ňovaných z testovaného materiálu a brání přímému kontaktu vzorku s buňkami, který by mohl vést k jejich eventuálnímu mechanickému poškození. Test se provádí ve 2 variantách – s neutrální červení (NČ) a s thiazolylovou modří (MTT).
Živá buňka aktivně přijímá neutrální červeň pinocytózou a ukládá ji do sekundárních lyso-somů, takže agarová vrstva v Petriho misce je lehce červeně zbarvená. Cytotoxický materiál po-škozující především buněčné membrány způsobí uvolnění barviva z lysosomů a jeho difúzi do relativně velké hmoty agarové vrstvy. Velikost odbarvené zóny charakterizuje objem uhynutých buněk.
Druhá varianta využívá transformace thiazolylové modře extramitochondriálními dehydro-genázami na barevné nerozpustné formazány. Plocha agaru, pod níž leží nepoškozené buňky, vy-kazuje modrofialové zbarvení. Ztráta aktivity dehydrogenáz u poškozených a mrtvých buněk se neprojeví změnou barvy; naopak tato zóna si uchovává původní zbarvení (světle nažloutlá). V obou variantách je možné v nezbarvené zóně také mikroskopicky hodnotit morfologii poškoze-ných buněk. Kontrast mezi zbarvenou a nezbarvenou plochou je v případě MTT výraznější než při použití NČ.
Oba zmíněné testy lze také uskutečnit na tomtéž substrátu – nejdříve s NČ, a pak s MTT. Pokud se neshoduje poškození membrán se ztrátou mitochondriální aktivity, je výsledný barevný obraz nejednotný, nepřekrývající se. K archivaci výsledků testů slouží fotografie Petriho misek.

19.6.2 Test na ultrafiltrech (Millipore)
Základní princip testu spočívá v tom, že buňky se pěstují na jedné straně filtru a z druhé strany je přiložen testovaný vzorek. Podobně jako agarová vrstva, filtr umožňuje definovaný kon-takt materiálu s buňkami a zabraňuje případnému jejich mechanickému poškození. Látky případně se uvolňující ze vzorku mohou filtrem také rovnoměrně difundovat do okolí. V tomto uspořádání se obvykle prokazuje sukcinát dehydrogenázová aktivitu (SDH) živých buněk. Po působení „barvicí“ směsi je plocha ultrafiltru se živými buňkami modrofialově zbarvena, oblast postižených buněk zůstává nezbarvena. Usušené membránové ultrafiltry se archivují přímo, ale mikroskopické hodnocení buněk není možné, neboť ultrafiltr není transparentní.
V jiném uspořádání testu na membránovém ultrafiltru lze prokazovat v živých buňkách enzymatickou transformaci fluoresceindiacetátu ve fluorescein (FDA). Protože vzniklý fluo-rescein neproniká přes buněčnou membránu, reakce se projeví žlutozelenou fluorescencí plochy živých buněk v UV světle. Zóna poškozených buněk nefluoreskuje. Archivují se usušené ultrafil-try, ale vhodnější jsou snímky pořízené v UV světle; ve viditelném světle se filtry jeví jako ne-zbarvené.

19.6.3 Stanovení metabolické a proliferační aktivity v mikrotitračních destičkách
Pro kvantitativní hodnocení buněčného metabolismu se nejčastěji používají testy založené na hodnocení dehydrogenázové aktivity (převážně v mitochondriích). Jejich principem je přemě-na žlutých tetrazoliových solí (XTT, WST-1) pomocí dehydrogenáz na rozpustné oranžové formazanové sole. Buňky jsou nasazeny do 96 jamkových mikrotitračních destiček a po 24 hodi-nové preinkubaci je médium vyměněno za medium obsahující výluh z testované látky. Po určité době (nejčastěji 24 hodin) je k buněčné kultuře přidán roztok XTT (resp. WST-1) a buňky jsou kultivovány další 2 hodiny. Po této době se měří množství vzniklých formazanových solí na fo-tometru. Vlnová délka pro měření absorbance je 450 nm, referenční vlnová délka je 690 nm.
Další možností je využít nepřímého kolorimetrického měření celkových proteinů. Toto nepřímé měření proliferační aktivity je založeno na barvení buněčných kultur v 96 jamkových mik-rotitračních destičkách pomocí Brilliant Blue, která se reverzibilně váže na buněčné proteiny. Množství absorbované barvy je měřeno na fotometru – vlnová délka pro měření absorbance je 570 nm, referenční vlnová délka je 405 nm.