inženýrství. Štěpí DNA v určitých specifických sekvencích (často jde o
palidromické sekvence) a u bakterií slouží jako ochrana před cizorodou DNA. Všechny nukleázy štěpí fosfodiesterickou vazbu v nukleových kyselinách.
RESTRIKČNÍ ANALÝZA DNA
Izolovaná nebo amplifikovaná DNA se často před další analýzou štěpí na menší fragmenty, které se pak rozdělí gelovou elektroforézou – čím je fragment menší, tím migruje rychleji a je dále od startu. K restrikční analýze DNA se užívají bakteriální restrikční endonukleázy (RE), které spolu s příslušnými metylázami tvoří systém chránící baktérie proti invazi cizorodé (virové) DNA. Rozpoznávací sekvence (tj. sekvence nukleotidů, kterou určitá RE rozpoznává) většiny enzymů je dlouhá 4 - 6 bp (obr. 3). Obecně platí, že čím je kratší rozpoznávací sekvence, tím se DNA štěpí častěji, tedy vznikají menší fragmenty.
V DNA se čtyřnukleotidové rozpoznávací místo vyskytuje přibližně
každých 44 = 256 nukleo-tidů, šestinukleotidové místo každých 4096 (46) a osminukleotidové místo každých 65536 (48) nukleotidů. Četnost štěpení je však ovlivněna i obsahem G + C v DNA, obsahem repetitivních sekvencí a degenerací některých rozpoznávacích sekvencí (tj. na jedné pozici rozpoznávací sekven-ce mohou být různé nukleotidy).
Obr. 3: Příklady některých restrikčních endonukleáz
Místo, ve kterém je rozpoznávací sekvence štěpena endonukleázou, je restrikční místo. Mohou existovat různé RE rozpoznávající stejné sekvence, dokonce mohou mít i stejné restrikční místo (např. HpaII a MspI), jindy je mají odlišná. Většina RE funguje při 37 C v mírně alkalickém prostředí (pH 7,2 - 7,6), jsou však i výjimky. Např. TaqI preferuje teplotu 65 – 67 C, naopak SmaI teplotu nižší, 25 – 30 C. Všechny RE ale vyža-dují přítomnost Mg2+.
Postupným separováním fragmentů urči-tého úseku DNA za použití více RE lze sestrojit restrikční mapu tohoto úseku (obr. 4). Nejprve se štěpí enzymem R1 a získá se fragment A, který po štěpení enzymem R2 dává fragmenty B, D. Když nejdříve štěpíme enzymem R2, dosta-neme fragment C, který po štěpení R1 dává fragmenty D a E. Délka fragmentů se určí podle polohy proužků na gelu. Takové restrikční mapy slouží k identifikaci určitého úseku DNA (jen s nepatrnou pravděpodobností by měly 2 různé úseky DNA stejnou restrikční mapu). Mapu lze však zhotovit jen pro krátké úseky DNA, které dávají konečný počet fragmentů jevící se na gelu jako samostatné proužky. Když se RE štěpí příliš dlouhý úsek nebo celý jaderný genom, je celkový počet fragmentů obrovský a na gelu je vidíme jako šmouhu.
(Kolářová)
Štěpení DNA restrikčními endonukleasami a rekombinantní DNA
Na rozdíl od proteinů nebo RNA nejsou geny v buňce přítomny jako samostatné entity, ale jsou součástí určitých úseků na celistvé molekule DNA. Jedním z mezníků, který usnadnil specifickou fragmentaci DNA a následně izolaci a pomnožení hledaného genu byl objev restrikčních endonukleas (1962; Aber, Nathans a Smith). Tyto enzymy, které jsou nejčastěji izolovány z bakterií, stěpí dvoušroubovici DNA v místech se specifickou lokální nukleotidovou sekvencí a vytvářejí fragmenty definované délky. Nejčastěji používaná skupina restrikčních endonukleas rozpoznává různé sekvence 4 až 8 nukleotidů na molekule DNA, kde štěpí. Společným rysem těchto sekvencí je, že je můžeme číst u dvouřetězcové molekuly zprava doleva na jednom řetězci stejně jako zleva doprava na řetězci druhém, hovoříme o palindromních sekvencích.
Obrázek 1: Štěpení dvouřetězcové molekuly DNA restrikčními endonukleasami a spojování vzniklých fragmentů. (A) Některé bakteriální enzymy štěpí DNA ve specifických sekvencích přičemž generují kohézní konce (např. Sau3A ze Staphylococcus auresus kmene 3A, BamHI z Bacillus amyloliquefaciens kmene H nebo EcoR I z Eschericha coli kmene RY 13 nebo tupé konce (např. Hpa I z Haemophilus parainfluenzae). (B) Komplementární kohézní konce (jednořetězcové úseky DNA) dvou různých molekul DNA se mohou spojovat vodíkovými můstky a po kovalentním spojení DNA ligasou vzniká rekombinantní DNA.
Různé druhy bakterií produkují různé restrikční endonukleázy, které jim slouží jako ochrana proti cizorodé DNA. Vlastní DNA těchto bakterií je v cílových místech chráněna proti štěpení metylací adeninu nebo cytosinu a cizorodá (např. virová) DNA, která většinou metylována není, je v buňce rozštěpena a tím inaktivována.
Je poměrně jednoduché nalézt restriční endonukleasy, které vyštěpí z DNA fragment obsahující např. hledaný gen. Známá velikost fragmentu může být následně využita pro jeho přečištění ze směsi úseků vzniklých při štěpení chromozomální DNA. Některé restrikční endonukleasy štěpí cílovou sekvenci tak, že zanechávají na koncích fragmentu krátké přečnívající jednořetězcové úseky nazývané kohézní konce. Tyto konce se mohou spojit vodíkovými můstky na základě komplementarity bazí s koncem jiného fragmentu DNA generovaným stejným enzymem (nebo enzymem produkujícím stejné kohézní konce) (Obr. 1B). Následným propojením konců pomocí enzymu DNA ligasy objeveného v roce 1967 Gellertem vzniká tzv. rekombinantní molekula DNA. DNA ligasa, která vytváří vazbu mezi 3’ hydroxylovou skupinou ribosy jedné molekuly DNA a fosfátem na 5’ hydroxylu ribosy molekuly druhé umožňuje i spojení DNA fragmentů generovaných restrikčními endonukleasami, které nevytváří kohézní konce, ale tzv. tupé konce. Spojit pak lze konce generované různými enzymy, avšak s menší účinností.
Žádné komentáře:
Okomentovat